Культивирование вирусов. Первичные культуры

Вирусы культивируются только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют:

1. животных;

2. куриные эмбрионы;

3. культуры клеток.

Первой моделью для культивирования и накопления вирусов явились восприимчивые животные. Лучше использовать молодых животных, тат как они более чувствительны к вирусам. Известно, что вирус энцефалита хорошо накапливается в мозге белых мышей, а вирусы полиомиелита в спинном мозге обезьян.

В конце 20-х годов начали использовать для накопления вирусов куриные эмбрионы. Одним из первых, кто широко использовал эту модель, был выдающийся австралийский вирусолог и иммунолог М. Вернет. Эта модель обладает исключительными преимуществами.

Куриные эмбрионы: 1) более стандартны, чем любые лабораторные животные; 2) значительно более стерильны; 3) чувствительны к очень МНОГИМ вирусам; 4) с ними значительно удобнее работать, чем с животными.

В каждой десятой доле миллилитра аллантоисной или амниотической жидкости накапливаются десятки миллионов вирусных частиц, а из каждого эмбриона можно получить 10-12 миллилитров аллантоисной жидкости.

Для культивирования вирусов используются различные структуры куриного эмбриона. Так вирус гриппа репродуцируется в амнионе; вирус герпеса, оспы в хорионе; в аллантоисной оболочке вирус Ньюкасл, паротита, гриппа; в желточном мешке рабдовирусы, вирус герпеса.

О развитии (репродукции) вирусов в курином эмбрионе свидетельствуют появление на хорионалантоисной оболочке включений (оспин) для вирусов оспы и герпеса, а также гибель эмбриона и реакция гемагглютинации. Последняя основана на способности ряда вирусов вызывать агглютинацию эритроцитов (птиц, человека и т.д.).

Однако куриные эмбрионы не универсальны, так как некоторые вирусы в них не репродуцируются.

К концу 40-х годов была предложена еще одна модель для культивирования вирусов - это культура клеток. Использование этой модели привело к большей стандартности, т.е. из одной клетки можно получать теоретически сколько угодно посевного материала. Это обеспечивает возможность вести исследования длительное время в одной и той же системе. Кроме того, удобно отбирать вирус, накапливающийся в жидкости, омывающей клетку.

Вместе с тем у культур клеток имеются и недостатки: они могут быть контаминированы (заражены) посторонними вирусами, что не позволяет их использовать для развития исследуемых вирусов. Необходимо специальное оборудование и реактивы. Куриным же эмбрионам достаточно тепла и влаги.

Культура клеток - это масса специальным образом обработанных клеток (они должны быть отделены одна от другой, чтобы могли расти), помещенная в определенную питательную среду. Эта среда должна содержать все необходимое для роста и размножения клеток (среда 199, среда Игла). Культуры клеток соответствующих органов и тканей, полученных таким образом, помещают во флаконы или пробирки, где они растут на их стенках в виде монослоя. Наиболее часто используют трипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной ткани.

Эти клетки в зависимости от количества жизнеспособных генераций подразделяются на: первичные, перевиваемые и полуперевиваемые.

Первичные культуры клеток получают чаще из эмбриональных тканей. В частности из почечной ткани эмбрионов обезьян и человека, амниона человека, эмбриона мыши, а также из почек взрослых обезьян. Они выдерживают не более 5-10 пассажей. Жизнеспособность этих культур ровняется 2-3 неделям.

Перевиваемые культуры готовят преимущественно из опухолевых клеток. К ним принадлежат линии, происшедшие от карциномы человека (HeLa, Мер-2, КВ) Очень распространена культура клеток HeLa, полученная из раковой опухоли, от которой погибла Генриетта Лак.

Преимуществом перевиваемых культур является их способность размножаться в лабораторных условиях в течение длительного периода, давая многочисленные генерации В течение многих лет они сохраняются при температуре - -70°С. Однако, благодаря соматическим мутациям они могут изменять морфологические и биохимические свойства.

Перевиваемые культуры клеток, также как и первичные могут быть заражены (контаминированы) различными неизвестными вирусами и микоплазмами. Поэтому они не могут использоваться в получении вирусных вакцин.

Полуперевиваемые культуры - это диплоидные клетки, получаемые из фибробластов человеческого эмбриона. Они выдерживают 20-30 пассажей, сохраняют исходный диплоидный набор хромосом, не подвергаются спонтанной трансформации. Их широко используют для получения вирусных вакцин.

В тех случаях, когда наличие дифференцированных клеток возможно только в культуре органа, так как не все виды клеток растут в виде монослоя, то такая суспензия ткани также называется культурой клеток.

У простых вирусов (их иногда «профессионально» называют «голыми») есть только одна белковой природы оболочка – капсид.

Капсид вирусов представляет собой непроницаемую оболочку, построенную из плотно соединяющихся между собой капсомеров. В состав капсида могут входить от нескольких до десятков белков, формирующих его капсомеры. Большинство капсомеров идентично по составу, поскольку они выполняют роль «кирпичиков» в белковой «стенке». Ряд капсомеров иного состава выполняет другую роль - они формируют участок капсид, обеспечивающий специфичность взаимодействия вируса с рецептором клетки. Капсомеры в капсиде располагаются по кубическому или спиральному типу симметрии.

У сложных вирусов (профессионализм - «одетых»), кроме капсида, есть дополнительная поверхностная оболочка - суперкапсид. Видимо, чаще всего суперкапсид формируется из цитоплазматической мембраны клетки, где идет репродукция вирионов (дополнительная оболочка некоторых вирусов, воспроизводимых в ядре клеток, может формироваться из ядерной мембраны этой клетки).

Отсюда следует, что основным структурным компонентом суперкапсида являются липиды клеточного происхождении. В состав липидного суперкапсида, как обязательный компонент, включаются белки, или гликопротеиды, но уже не клеточные, а вирусоспецифические (например, гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа). Эти вирусоспецифические белки суперкапсида обеспечивают специфичность взаимодействия вируса с клеткой.

Вот этот последний принцип классификации всех вирусов является общепризнанным и наиболее часто используемым. В то же время, сказать, что такой-то вирус, ДНК-овый или РНК- овый, значит, еще ничего не сказать.

Дело в том, что «нуклеиновая начинка» вируса не только существенно отличается от таковой у бактерий, но и чрезвычайно разнообразна по составу и форме.

Во-первых, следует отметить, что и ДНК, и РНК в составе вирионов могут быть и двунитевыми, и однонитевыми.

Во-вторых, и ДНК, и РНК в составе вириона могут быть как в су перепирал изованной форме, так и в относительно линейной.

В-третьих, геном вируса может быть представлен двумя идентичными молекулами однонитевой плюс-РНК (вирус иммунодефицита человека-ВИЧ).

В-четвертых, геном вируса может состоять из однонитевой РНК, разделенной на несколько сегментов (вирус гриппа).

И, наконец, в-пятых, как уже явствует из предыдущего, однонитевые РНК в составе вириона могут быть, как плюс-цепями и использоваться как мРНК, так и минус-цепями, служащими матрицами для синтеза плюс-цепей РНК.

Таким образом, геном вируса отличается от генома любой клетки не только принципиально - наличием нуклеиновой кислоты только одного типа, но и большим разнообразием в форме и варианте генетического материала.

Естественно, что такие существенные особенности структуры генетической информации вирусов должны находить отображение в процессе взаимодействия вирусов с клетками.